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    甲型流感病毒(IAV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)新品

    發布日期: 2023-03-29
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    甲型流感病毒(IAV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)新品

    【產品名稱】

    商品名稱:甲型流感病毒(IAV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)新品

    Name :Avian Influenza Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

    【包裝規格】50T/盒

    【預期用途】

    甲型流感是由甲型流感病毒(AIV)引起的一種禽類傳染病,雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽均可感染,發病情況

    差別較大,有的出現急性死亡,有的無癥狀帶毒。水禽是 AIV 的自然宿主,也是流感病毒的天然基因庫,幾乎

    所有亞型的流感病毒都可以在水禽中分離到[1]。在世界范圍內,家禽中流行的主要有 H5、H6、H7、H9 等亞型。

    H5 和 H7 亞型的某些毒株可以造成禽類很高的發病率和死亡率,被稱為高致病性甲型流感(HPAI)病毒。OIE 將

    高致病性甲型流感列為 A 類動物疫病,我國也將其列為一類動物疫病[2-3]。

    本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理,檢測甲型流感病毒,對甲型流感診斷有重要指導意義。

    【檢驗原理】

    本試劑盒針對甲型流感病毒 M 基因高度保守區域設計特異性引物和探針,在反應體系中含甲型流感病毒基

    因組模板的情況下,PCR 反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對 PCR 過程中相應通道的信號強度進行實時

    監測和輸出,實現檢測結果的定性、定量分析。

    【試劑組成】

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    注:1)不同批號試劑不能混用。

    2)試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。

    【儲存條件及有效期】

    -20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過5 次,有效期12 個月。

    【適用儀器】

    ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量PCR 檢測儀。

    【標本采集】

    病死或撲殺動物,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活動物,用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄

    物,置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

    【保存和運輸】

    上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,

    嚴禁反復凍融。

    【使用方法】

    1. 樣品處理(樣本處理區)

    1.1 樣本前處理

    每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生

    理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離

    心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

    1.2 核酸提取

    推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提

    取,請按照試劑說明書進行操作。

    2. 試劑配制(試劑準備區)

    根據待檢測樣本總數,設所需要的PCR 反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數

    每滿10 份,多配制1 份),每測試反應體系配制如下表:

    22222.png

    將混合好的測試反應液分裝到PCR 反應管中,21uL/管。

    3. 加樣(樣本處理區)

    將步驟1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,

    短暫離心。

    4. PCR 擴增(核酸擴增區)

    4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR 儀反應槽內;

    4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;熒光通道選擇:

    檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇ROX 參比熒光,

    選擇None 即可。

    4.3 推薦循環參數設置:

    3333.png

    5. 結果分析判定

    5.1 結果分析條件設定

    設置Baseline 和Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像

    調節Baseline 的start 值(一般可在3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在5~20 范圍內調節),以及Threshold 的

    Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。

    5.2 結果判斷

    陽性:檢測通道Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數增長曲線;

    可疑:檢測通道35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線,

    判定為陽性,否則為陰性;

    陰性:樣本檢測結果Ct 值>38 或無Ct 值。

    6. 質控標準

    陰性質控品:Ct>38 或無Ct 值顯示;

    陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且Ct 值≤32;以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

    7.檢測方法的局限性

    1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

    2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

    3.陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

    4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

    5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

    6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

    7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

    【注意事項】

    1.所有操作嚴格按照說明書進行;

    2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,混勻并短暫離心;

    3.反應液應避光保存;

    4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

    5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

    6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

    7.實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

    8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

    【參考文獻】

    [1] Webster R G, Bean W J, Gorman O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J]. Microbiological

    Reviews, 1992, 56(1): 152-179.

    [2] Shortridge K. Avian influenza A viruses of southern China and Hong Kong: ecological aspects and implications for

    man [J]. Bulletin of the World Health Organization, 1982, 60(1): 129.

    [3] 張燁, 舒躍龍. 2004–2012 年我國甲型流感流行情況 [J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2013, 27(3): 239-240.【生

    產企業】

    企業名稱:上海晅科生物科技有限公司


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